［摘要］目的：研究生理状态下细胞内Ca2+池的分布以及IP3引起Ca2+释放的量，以进一步了解唾液分泌机制。方法：利用全细胞膜片钳技术对分离的大鼠颌下腺腺泡细胞进行膜电流测量。结果：乙酰胆碱引起定量Ca2+释放；光分解Caged IP3引起定量Ca2+释放；电流振动是细胞内Ca2+浓度振动性变化的结果。结论：IP3敏感的细胞内Ca2+池其释放量依赖于IP3浓度，主要分布在CL-通道存在的细胞膜下。
［关键词］ 膜片钳； 颌下腺腺泡细胞； IP3； 细胞内Ca2+池； 定量Ca2+释放
关于唾液的分泌，多数学者认为：当乙酰胆碱(Ach)与受体结合后，通过细胞内信息传导系统，使细胞内游离Ca2+离子浓度(〔Ca2+〕i)升高，激活K+、Cl-离子通道。Cl-离子由细胞内向腺腔移动，带动Na+、H2O通过细胞间隙进入腺腔，形成离子液，进而从导管排出形成唾液。对于〔Ca2+〕i升高的机制，在胰腺外分泌细胞及颌下腺腺泡细胞等已获得证明，即：由激动剂引起的〔Ca2+〕i升高是由于Ca2+离子从细胞内Ca2+离子储存部Ca2+池(Ca2+ store)释放产生的。当Ach与受体结合后，通过产生GTP结合蛋白，进而激活磷酯酶C(PLC)，PLC使磷酯酰肌醇4、5—二磷酸(PIP2)水解而生成二酰基甘油(DG)和肌醇1、4、5—三磷酸(IP3)。DG可使蛋白激酶 C(PKC)活化，IP3作为第二信使，进入细胞质，作用于细胞内Ca2+池，引起Ca2+离子释放［1,2］。然而，细胞内Ca2+池的分布，以及IP3引起Ca2+释放的量，到目前为止仍然是电生理学讨论的重点问题。我们利用全细胞膜片钳技术(Patch-clamp whole cell recording techniques)［3］对分离的颌下腺腺泡细胞进行了实验研究。结果显示，由IP3引起的Ca2+释放，其释放量是依赖于IP3浓度的。因此，我们推论，在颌下腺腺泡细胞，由IP3引起的Ca2+释放是一个定量释放的过程(Quantal Ca2+ release)。同时实验结果还显示，IP3敏感的细胞内Ca2+池主要分布在细胞膜下。
材料和方法
一、细胞分离
将雄性大鼠(Wistar 系250-300g)麻醉,摘除颌下腺并剪成组织碎块后，置于含有200U/ml胶原蛋白酶(Collagenase, Wako clem)的溶液中,在37℃恒温条件下，进行20～25min的消化处理，并使之轻微振动，之后将组织混悬液进行离心(1200r/min),连续清洗2次后置于倒立显微镜下进行实验观察。
二、细胞膜电流测定
细胞膜电流的测定是通过全细胞膜片钳方法进行的。电极(主电极)是使用玻璃管通过电极拉制器制作的。当用标准电极液(细胞内液)充填电极时,电极阻抗为3-5Mega。将连接于膜片钳放大器(list,EPC-7)的主电极和副电极置于显微镜载物台上的容器内（含标准细胞外液）时，由于两者间形成回路，而测定电位固定时流动的电流。
三、全细胞的形成
首先将主、副电极间电位差调整为零，之后给予1mV，2Hz的电压脉冲，在监视流动电流的同时，使主电极逐渐接触细胞表面，继而施加负压吸引，使电极和细胞膜片间的阻抗达到gigaΩ水平，流动电流消失而形成高阻封接(giga-seal)。其次，使电极电位钳制在-60mV，并给予到0mV的除极化电压脉冲。再次施加负压，当膜片破裂时，可记录到容量性电流的增大和0mV电位的外向性电流,形成全细胞记录形式(whole-cell recording)。这时由于电极与细胞内相通，细胞内的离子组成和电极内的离子组成逐渐等同，电极电位也和细胞膜电位相等，这时将膜电位持续固定在-60mV，记录由激动剂引起的电流活动。
四、溶液和激动剂
标准细胞外液的组成为(m mol/L)：NaCl∶140; kCl∶4.7; CaCl2∶1.0; MgCl2∶1.13; Hepes∶10; Glucose∶10；pH值用NaOH调节到7.2。
标准细胞内液的组成为(m mol/L)：KCl∶140； MgCl2∶1.13; Hepes∶10; Glucose∶10; Na2ATP∶1; EGTA∶0.25; pH值用KOH调节到7.2。
激动剂的浓度及使用方法：Ach(5nmol/L)，（25nmol/L)，通过细胞外灌流装置投与。
